Высокая чувствительность метода обусловлена наличием этапа предобработки. Во время него с помощью специального раствора
(Буфер М) при температуре 95°С происходит частичное растворение кератин-содержащего материала в образце. Это позволяет проводить очистку ДНК грибов, упростить дальнейшую процедуру экстракции, увеличив аналитическую чувствительность ПЦР-исследования.

Предобработка буфером М и прогрев 95^оС - 10 мин.

Предобработка водой и прогрев 95^оС - 10 мин.

1

2

1

2

ПЦР-РВ АмплиПрайм® Дерматофиты является высокочувствительным методом. Концентрация ДНК дерматофитов, при которой 95% тестов дают положительный результат составляет всего 500 копий на мл. Поэтому возможно пересечение пороговой линии на поздних циклах по каналам, не являющимися контрольным. Ложноположительный результат возможен в случае контаминации, а истинный результат, определяемый на поздних циклах, является следствием крайне низкой концентрации ДНК дерматофитов в образце. Контаминация дерматофитами, не присутствующих в исследуемом образце, будет характеризоваться появлением кривой флуоресценции выше порогового цикла как в исследуемой пробе, так и в отрицательном контрольном образце (ОКО).

Исследуемый образец:

Значение по каналу определено
не выше граничного

ПКО: Значение по каналу определено не выше граничного

Пороговая линия

1

2

3

1

2

3

Исследуемый образец:

Значение по каналу определено
на поздних циклах

ПКО: Значение по каналу определено не выше граничного

Пороговая линия

1

2

3

1

2

3

Ложноположительные результаты на аналитическом этапе

Возможна в связи с неаккуратным приготовлением реакционной смеси, либо распространением грибов-дерматофитов с наружной стороны пробирок. Учитывая малый вес биологических образцов (чешуйки кожи, элементы подногтевого дебриса и частицы волос), отсутствие удерживающей жидкой среды в образце, возможна тотальная контаминация одним образцом лабораторного стола, одежды и перчаток исследователя.

Для защиты от контаминации ампликонами на аналитическом этапе используется УДГ – урацил-ДНК-гликозилаза. В случае попадания ампликонов УДГ отщепляет остатки урацила от сахаро-фосфатного остова, при это он никак не влияет на дУТФ, находящиеся в смеси. Образующиеся в результате работы УДГ сайты, лишённые оснований, так называемые абазические или апиримидиновые сайты, являются нестабильными и достаточно легко гидролизуются при повышении температуры смеси с разрешением цепи ДНК
на отдельные ультракороткие фрагменты.